本期主要為大家推薦的一篇是關于circRNA海綿吸附作用于miRNA調(diào)節(jié)細胞周期蛋白依靠性激酶的表達，再通過探討細胞周期蛋白依靠性激酶相關的轉錄因子來在前列腺癌中的作用。

前列腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是導致男性癌癥相關死亡的第二大原因。目前器官前列腺癌的主要治療方法是通過前列腺切除術或放射治療，但是轉移性前列腺癌的治療方法主要還是通過雄激素剝奪療法。一旦出現(xiàn)激素耐受后，前列腺癌迅速發(fā)展，晚期前列腺癌通常在18個月內(nèi)致命。所以需要進一步了解前列腺癌變和耐藥的分子機制。

細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）是絲氨酸/蘇氨酸激酶，CDKs分子至少有13種，通過改變其活性來介導腫瘤相關的細胞周期絮亂，其中CDK12和CDK13研究頗多。在前列腺癌樣本中，CDK12表達異常，表明CDK12缺失導致基因座的高度重復性增益從而參與細胞周期和DNA復制，而CDK13在前列腺癌中的研究較少。

研究表明CircRNA在多種疾病中表達下調(diào)，通過海綿吸附作用miRNA在腫瘤的增殖、凋亡以及耐藥等生物學過程中發(fā)揮獨特的功能。因此本文作者通過設計內(nèi)源性基因CDK13在轉錄水平上計劃來調(diào)控轉錄因子E2F5的表達，從而促進CircCDK13的形成，海綿吸附作用于miR-212-5p/449a從而正反饋調(diào)控E2F5的表達來探討前列腺癌的發(fā)展。

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33390186/，影響因子：7.038

01??CDK13在前列腺癌組織樣本中高表達

作者選取30對前列腺癌組織和良性前列腺增生組織進行QPCR和WB驗證，結果表明前列腺癌組織中的CDK12表達水平顯著高于良性前列腺增生組織；從TCGA數(shù)據(jù)庫中選取94例列腺癌組織數(shù)據(jù)和42例良性前列腺增生組織數(shù)據(jù)分析，所得結果跟QPCR和WB結果相一致。

02??過表達CDK13促進前列腺癌細胞的增殖以及抑制細胞凋亡

用QPCR和WB的方法驗證CDK13在四株不同前列腺癌細胞中的表達情況，相對于正常前列腺上皮細胞，CDK12在PC3和 22RV1細胞中表達顯著升高；同時也進行HE和免疫組化實驗，結果和QPCR、WB一樣；在PC3和22RV1細胞中構建敲低和過表達穩(wěn)轉細胞株，通過CCK8，平板克隆形成實驗檢測增殖、以及流式檢測凋亡，這些結果表明CDK13能促進前列腺癌細胞的增殖以及抑制細胞凋亡。

03??CDK13促進E2F5在前列腺癌細胞中高表達

通過CoIP-MS實驗，用CDK13調(diào)取相互作用蛋白，結果表明，共調(diào)取出10種蛋白，其中轉錄因子E2F5最有可能跟CDK13相互作用。用2對前列腺癌和正常前列腺上皮組織芯片觀察E2F5的表達水平，結果表明E2F5在前列腺癌組織芯片中高表達；通過免疫共沉淀和免疫熒光，結果表明CDK13和E2F5在PC3細胞和前列腺癌組織中存在強烈的相互作用；作者也收集了30對癌組織和正常組織進行QPCR鑒定，以及在TCGA數(shù)據(jù)庫中和應用免疫組化觀察E2F5在組織中的表達情況，這些結果表明E2F5在前列腺組織中高表達。

作者通過CRISPR-Cas9技術激活內(nèi)源性CDK13轉錄和在PC12細胞中瞬轉敲低以及過表達E2F5質(zhì)粒觀察CDK13、E2F5和p12基因表達水平，結果表明，相對于過表達E2F5質(zhì)粒，敲低E2F5引起E2F5和CDK13的表達水平顯著降低。作者接下來通過MTS實驗、平板克隆形成實驗以及蛋白pull down實驗表明CDK13和E2F5相互作用并促進PC12和22RV1細胞的增殖。

04??激活內(nèi)源性CDK13轉錄引起CircCDK13的形成引起E2F5表達上調(diào)

作者發(fā)現(xiàn)在激活內(nèi)源性CDK13轉錄細胞中的CDK13和E2F5蛋白表達水平呈正相關；在敲低CDK13細胞中觀察E2F5蛋白水平顯著降低，但是E2F5 mRNA表達水平無明顯變化。在激活內(nèi)源性CDK13轉錄細胞中發(fā)現(xiàn)CircCDK13高表達。接著作者通過觀察過表達CircCDK13在PC12和22RV1的增殖情況，結果表明過表達CircCDK13能夠促進細胞的增殖能力。

05??CircCDK13海綿吸附作用miR-221-5p/449a調(diào)控E2F5蛋白表達

作者通過網(wǎng)站預測找出能夠和CircCDK13相互結合作用的miRNA，通過RNA pull down結合RT-QPCR的方法確定miR-212-5p和miR-449a最有可能跟CircCDK13相互結合，然后通過雙熒光素酶以及亞細胞定位最終確定它們的結合關系。最后通過合成miR-212-5p和miR-449a mimic看下游CDK13和E2F2蛋白表達情況，結果表明CDK13和E2F2蛋白表達水平顯著減低。

06??E2F2激活CDK13基因的轉錄并正反饋調(diào)控circCDK13的形成

過表達或者敲低E2F2在PC3細胞中，QPCR結果表明過表達E2F2后，CDK13和circCDK13 mRNA表達水平顯著升高，反之則降低。通過網(wǎng)站預測CDK13基因和轉錄因子E2F2的結合位點，進行Chip和雙熒光素酶實驗，結果說明了CDK13和E2F2能夠相互結合。接下來為了闡明CDK13-circCDK13-miR-212-5p/miR-449a-E2F5之間的調(diào)控關系對前列腺癌發(fā)展的影響，分別在PC3和22RV1細胞中共瞬轉過表達circCDK13和過表達E2F5質(zhì)粒觀察E2F5、CDK13和p21的表達情況，結果表明E2F5和CDK13表達水平顯著升高，而p21表達水平顯著降低。最后敲低circCDK13和miR-212-5p/miR-449a mimic相互作用觀察E2F5、CDK13和p21在PC3、22RV1細胞的表達情況和影響細胞增殖的情況，結果表明敲低circCDK13的同時過表達miR-212-5p/miR-449a，E2F5、CDK1蛋白表達水平顯著降低，而p21表達水平顯著升高，細胞的增殖速度也起到了抑制作用。

07??CDK13-circCDK13-miR-212-5p/miR-449a-E2F5調(diào)節(jié)軸參與體內(nèi)前列腺腫瘤的發(fā)生

為了明確CDK13-circCDK13-miR-212-5p/miR-449a-E2F5在前列腺腫瘤中的作用，作者構建了sh-circCDK13、sh-E2F5以及sh-circCDK13+sh-E2F5穩(wěn)轉細胞株用于接種動物，結果表明，sh-circCDK13和sh-E2F5共同作用后明顯抑制了腫瘤的發(fā)展，腫瘤體積顯著減少。同時WB檢測腫瘤組織中相關蛋白表達水平和和tunel實驗檢測細胞凋亡情況，結果表明CDK13和E2F5蛋白表達水平顯著降低，而p12蛋白表達顯著升高。以上結果說明了同時抑制circCDK13和E2F5對前列腺腫瘤的發(fā)展起到抑制的作用。