近期,意大利的耶穌圣嬰兒童醫(yī)院的Angela Di Giannatale團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤來源外泌體攜帶miR-375,遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移到骨髓創(chuàng)造有利的環(huán)境,從而促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移,該研究結(jié)果發(fā)表于Journal of Extracellular Vesicles 。
01??案例文章
骨髓是神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma ,NB)轉(zhuǎn)移的靶器官,NB侵襲骨髓的機(jī)制仍然是未知的。腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要作用,間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤間質(zhì)的組成部分。與NB患者(無骨髓轉(zhuǎn)移)相比,骨髓轉(zhuǎn)移NB患者的骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(BM-MSCs)展現(xiàn)出較強(qiáng)的成骨分化潛能。骨髓轉(zhuǎn)移的的NB細(xì)胞分泌的外泌體高表達(dá)miR-375,促進(jìn)BM-MSCs成骨分化。臨床數(shù)據(jù)顯示,miR-375高表達(dá)與NB患者骨髓轉(zhuǎn)移相關(guān)。結(jié)果表明,外泌體miR-375在骨髓創(chuàng)造一個(gè)有利的微環(huán)境從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。miR-375作為一個(gè)新的生物標(biāo)志物,也是NB患者發(fā)生骨髓轉(zhuǎn)移的潛在靶標(biāo)。
02??案例文章的研究內(nèi)容
? NB 和 BM 轉(zhuǎn)移患者的BM-MSCs 有較強(qiáng)的成骨分化潛力
分別從12個(gè)NB患者(8個(gè)骨轉(zhuǎn)移,MBM-MSCs;4個(gè)無骨轉(zhuǎn)移,NMBM-MSCs)和7個(gè)健康人(HC-MSCs)分離MSCs。流式分別檢測(cè)MSCs標(biāo)志物(CD90,CD105, CD81, CD9 )和NB細(xì)胞表面標(biāo)志物(GD2)均為陽性;造血干細(xì)胞標(biāo)志物(CD34, CD45 )和神經(jīng)元標(biāo)志物(CD56),為陰性。原代分離的3組MSCs群體倍增時(shí)間無差異。成骨分化和qPCR檢測(cè)成骨分化相關(guān)因子(RUNX2, OSTERIX,BMP2,SPP1),MBM-MSCs 有較強(qiáng)的成骨分化潛能。
? BM轉(zhuǎn)移的NB細(xì)胞來源外泌體增強(qiáng)HC-MSCs的成骨分化
分別從原代腫瘤細(xì)胞(IMR-32 and IGR-NB8 cells )和BM轉(zhuǎn)移的NB細(xì)胞(SKNSH, SHSY5Y, SKNBe2 c,LAN-1 and IGR-N91 )分離外泌體。IMR32 exo和SHSY5Y-derived exo分別與HC-MSCs共培養(yǎng)24h,共聚焦成像、qPCR檢測(cè)、WB檢測(cè)和成骨誘導(dǎo)表明,與IMR32 exo 組(原位腫瘤細(xì)胞)相比,SHSY5Y-derived exo組(骨轉(zhuǎn)移來源腫瘤細(xì)胞)MSCs內(nèi)化的外泌體、骨分化相關(guān)因子(RUNX2, OSTERIX,BMP2,SPP1)和鈣沉積被顯著提高;
? miR-375在BM-metastasisNB細(xì)胞來源的外泌體和MBM-MSCs中高表達(dá)
RT-qPCR分別檢測(cè)7個(gè)NB細(xì)胞(IMR-32,IGR-NB8 cells,SKNSH, SHSY5Y, SKNBe2 c,LAN-1,IGR-N91 )來源的外泌體miRNA表達(dá)。與原代腫瘤細(xì)胞來源外泌體相比,骨轉(zhuǎn)移NB細(xì)胞來源外泌體中,miR-375, miR-365a-3p, miR-193b-3p, miR-18a-3p, miR-140-5p 表達(dá)上調(diào);另外,在MBM-MSCs 或SHSY5Y-exosomes /HC-MSCs 共培養(yǎng)模型中,miR-375也顯著上調(diào)。
靶標(biāo)預(yù)測(cè)顯示,YAP1 和DEPTOR 可能是miR-375 的潛在靶點(diǎn),YAP1參與Hippo 信號(hào)通路,抑制RUNX2的活性(成骨細(xì)胞成熟必須的因子)。因此,作者推測(cè)NB分泌的外泌體攜帶miR-375到骨髓通過抑制YAP1促進(jìn)成骨分化。在骨轉(zhuǎn)移來源的NB 細(xì)胞中,YAP1 的mRNA和蛋白水平顯著低于原位腫瘤細(xì)胞;不同腫瘤細(xì)胞來源的外泌體與HC-MSCs共培養(yǎng),SH5YSY-derived exosomes 組YAP1和DEPTOR 的mRNA、蛋白水平顯著降低。在MBM, NMBM- 和HCMSCs ,YAP1 的mRNA和蛋白表達(dá)在MBM-MSCs中也顯著降低。
? MiR-375調(diào)控成骨轉(zhuǎn)化因子的表達(dá)
分別構(gòu)建了MiR-375過表達(dá)NMBM-MSC細(xì)胞,及MiR-375下調(diào)MBM-MSC 細(xì)胞。RT-qPCR結(jié)果表明,MiR-375過表達(dá)顯著下調(diào)YAP1的mRNA和蛋白水平,然而成骨標(biāo)志物SPP1 and OSTERIX 顯著上調(diào)。相反的,抑制miR-375可以上調(diào)YAP1和DEPTOR 的mRNA和蛋白表達(dá)。
? MiR-375表達(dá)與NB患者的骨疾病相關(guān)?
為了探索MiR-375與NB患者骨髓浸潤的相關(guān)性,17個(gè)HC,7個(gè)NMBM 患者和14個(gè)MBM患者的外周血來源的外泌體被收集,Q-PCR 分別檢測(cè)患者及患者血清來源的外泌體,在MBM組,MiR-375的表達(dá)上調(diào)。隨后27個(gè)NMBM和33個(gè)MBM患者的骨髓樣本被收集, 突觸素(觀察NB細(xì)胞的侵襲)、miR-375 表達(dá)水平被評(píng)估;miR-375 不僅在NB細(xì)胞中表達(dá)也在成骨及骨髓的其他細(xì)胞中表達(dá)。miR-375 在NB患者的臨床相關(guān)性分析顯示,miR-375陽性與NB患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移正相關(guān)。在SCID小鼠模型中,PKH26 標(biāo)記的外泌體可以轉(zhuǎn)移到骨髓,并且外泌體注射組miR-375表達(dá)顯著升高。
總之,本研究闡明了神經(jīng)母細(xì)胞瘤通過外泌體中的miR-375,促進(jìn)骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化。
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